Use of a commercial agarose gel for analysis of urinary glycosaminoglycans in mucopolysaccharidoses

ABSTRACT Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of inherited metabolic disorders caused by deficiency of enzymes that degrade glycosaminoglycans (GAGs). Urinary excretion of GAGs is a common feature of MPS, and is considered their major biomarker. We aimed to adapt the GAG electrophoresis method to a commercial agarose gel which would be able to separate urinary GAGs in a simpler way with good sensitivity and reproducibility. Urine samples from patients previously diagnosed with MPS I, IV, and VI were used as electrophoretic standards. Samples from patients on enzyme replacement therapy (ERT) were also assessed. Commercial agarose gel electrophoresis was effective, showing proper definition and separation of GAG bands. Detection sensitivity exceeded 0.1 µg and band reproducibility were consistent. GAG bands quantified in urine samples from patients on ERT correlated very strongly (correlation coefficient = 0.98) with total GAG concentrations. This application of gel electrophoresis demonstrates the possibility of monitoring patients with MPS treated with ERT by analyzing separately the GAGs excreted in urine. We suggest this process should be applied to MPS screening as well as to follow-up of patients on treatment.

Importancia médica del glucocáliz endotelial: Parte 2: su papel en enfermedades vasculares y complicaciones de la diabetes mellitus / Medical significance of endothelial glycocalyx: Part 2: Its role in vascular diseases and in diabetic complications

El glucocáliz endotelial es una capa constituida por glucosaminoglicanos, proteoglicanos y glucoproteínas que cubre al endotelio en su cara luminal. La participación del deterioro del glucocáliz endotelial parece esencial en los pasos iniciales de la fisiopatología de la aterosclerosis, de las complicaciones microangiopáticas de la diabetes mellitus y de la enfermedad venosa crónica. Los factores de riesgo de la aterosclerosis como la hipercolesterolemia, la hiperglucemia, la inflamación, el exceso de sodio y las fuerzas de tensión alteradas causan deterioro del glucocáliz. Esto provoca disfunción endotelial y permite la filtración de lipoproteínas (LDL) y de leucocitos al espacio subendotelial, iniciando la formación de la placa de ateroma. En la diabetes el glucocáliz adelgazado, principalmente por estrés oxidativo, posibilita la filtración de proteínas (albuminuria) y el trastorno endotelial de la microangiopatía. La hipertensión venosa crónica altera las fuerzas de tensión y daña el glucocáliz, lo que permite la filtración de leucocitos a las partes más profundas de la pared venosa, iniciando la inflamación y el deterioro morfológico y funcional de las venas que lleva a la enfermedad venosa crónica. El tratamiento con glucosaminoglicanos (sulodexida) logra prevenir o revertir el daño al glucocáliz endotelial y algunas de sus consecuencias; es eficaz en la enfermedad venosa crónica, especialmente con úlceras venosas. También ha sido útil en aterosclerosis obliterante de miembros inferiores y en la nefropatía diabética con albuminuria.

Endothelial glycocalyx is a layer composed by glycosaminoglycans, proteoglycans and glycoproteins attached to the vascular endothelial luminal surface. Shredding of glycocalyx appears as an essential initial step in the pathophysiology of atherosclerosis and microangiopathic complications of diabetes mellitus, as well as in chronic venous disease. Atherosclerosis risk factors, as hypercholesterolemia (LDL), hyperglycemia, inflammation, salt excess and altered shear stress can damage glycocalyx. This lead to endothelial dysfunction and allows LDL and leukocytes to filtrate to the subendothelial space initiating atheroma plaque formation. Degradation of glycocalyx in diabetes mellitus is mainly due to oxidative stress and enables protein filtration (albuminuria) and endothelial disorder of microangiopathy. Chronic venous hypertension brings to altered shears stress which results in shredded glycocalyx, this allows leukocytes to migrate into venous wall and initiate inflammation leading to morphologic and functional venous changes of the chronic venous disease. Treatment with glycosaminoglycans (sulodexide) prevents or recovers the damaged glycocalyx and several of its consequences. This drug improves chronic venous disease and promotes healing of chronic venous ulcers. It has also been useful in peripheral arterial obstructive disease and in diabetic nephropathy with albuminuria.

Anti-Proteinuric Effect of Sulodexide in Immunoglobulin A Nephropathy

PURPOSE: We conducted a multi-center randomized double-blind study to determine the effects of 6-month therapy with sulodexide on urinary protein excretion in patients with idiopathic Immunoglobulin A (IgA) nephropathy. MATERIALS AND METHODS: A total of seventy-seven patients participated in the study. They were randomly allocated to one of three groups: sulodexide 75 mg or 150 mg daily or the placebo for 6 months. The primary end point was the achievement, at 6 months, of at least 50% reduction in urine protein/creatinine ratio (UPCR) from the baseline value. RESULTS: At 6 months, the primary end point was achieved by 12.5% of the patients assigned to the placebo, 4.0% of the patients assigned to sulodexide 75 mg daily and 21.4% of those assigned to 150 mg (p=0.308). Treatment with sulodexide 150 mg daily for 6 months significantly reduced log UPCR from 6.38+/-0.77 at baseline to 5.98+/-0.94 at 6 months (p=0.045), while treatment with sulodexide 75 mg daily and placebo did not. CONCLUSION: A 6-month treatment with sulodexide did not achieve 50% reduction of urinary protein excretion in IgA nephropathy patients, but showed a tendency to increase the time-dependent anti-proteinuric effect. Therefore, long-term clinical trials on a larger scale are warranted to elucidate the hypothesis that sulodexide affords renal protection in IgA nephropathy patients.

Efecto del sulodexide sobre la capacidad de relajación y alteraciones estructurales de la arteria aorta en ratas diabéticas por estreptozotocina / Effect of sulodexide on aortic vasodilation capacity and associated morphological changes in rats with streptozotocin-induced diabetes

La disfunción endotelial (DE) se presenta en pacientes con hipercolesterolemia, hipertensión arterial, obesidad y diabetes mellitus. Evidencias sugieren un papel de los glicosaminoglicanos en la DE. Evaluamos el efecto del sulodexide (SLD), un glicosaminoglicano utilizado en el tratamiento de la albuminuria y la enfermedad isquémica en pacientes diabéticos, sobre la relajación arterial y los cambios morfológicos en un modelo experimental de diabetes tipo 1. La diabetes se indujo a ratas Sprague Dawley administrando estreptozotocina (STZ), 60 mg/kg, i.v. Los animales fueron distribuidos en los siguientes grupos: I= control, II= diabéticas, III: control + sulodexide, IV= diabéticas + sulodexide (15 mg/kg/día s.c). A los 3 meses fueron sacrificados, las aortas extraídas para evaluar la relajación vascular inducida por acetilcolina (Ach) y nitroprusiato de sodio en anillos precontraídos con fenilefrina. Fueron evaluadas histológicamente mediante microscopía de luz y coloraciones diversas. El SLD in vitro no modificó la tensión basal de los anillos arteriales en reposo o precontraídos con fenilefrina. La diabetes disminuyó la capacidad de relajación arterial en respuesta a la Ach en un 28,8-35,1% vs control, efecto que fue prevenido por SLD. No se observó diferencia significativa en la relajación inducida por nitroprusiato sódico entre los grupos. El estudio histológico en los animales diabéticos mostró alteraciones estructurales, particularmente en la íntima y la adventicia, cambios que fueron prevenidos por el tratamiento con SLD. Nuestros resultados apoyan la potencial utilidad terapéutica del SLD en el tratamiento de la disfunción endotelial.

Endothelial dysfunction (ED) is observed in patients with hypercholesterolemia, arterial hypertension, obesity and diabetes mellitus. Recent evidences suggest the involvement of glycosaminoglycans(GSG) in ED. We evaluated the effect of sulodexide (SLD), a natural GSG used in albuminuria and ischemic diabetes treatment, on arterial relaxation and vascular morphological changes in a diabetic type I model. Diabetes was induced, in Sprague-Dawley rats by streptozotocine (STZ) administration, 60 mg, iv. Rats were divided into four groups; I: control, II: diabetics, III: control + SLD, IV: diabetics treated with SLD (15 mg/day). After three months, phenylephrine precontracted aortic rings were used to evaluate acetylcholine (ACh) and sodium nitroprusside (NPS) relaxation capacities. Light microscopy of aorta was done with several staining procedures. In vitro, SLD did not change smooth muscle tone in resting or phenylephrine precontracted aortic rings. In diabetic rats, ACh relaxation was 28.8-35.1% lower than in control rats. Diabetic rats treated with SLD showed aortic ACh relaxation similar to control rats. No significative statistical difference was found in endothelium-independent NPS relaxation, between the different groups. Light microscopy histological studies revealed important morphological alterations, particularly in intima and adventitia layers of aortic artery; those changes were dramatically reversed in SLD treated rats. Our experiments support the conclusion that SLD is a potential drug for improving endothelial dysfunction in diabetes.

Efeitos dos glicosaminoglicanos e sulfato de condroitina A sobre a cartilagem articular normal e com doença articular degenerativa em cães / Glycosaminoglycans and chondroitin sulphate A effects on normal and osteoarthritic articular cartilage in dogs

Avaliaram-se os efeitos dos precursores dos glicosaminoglicanos (GAG) e do sulfato de condroitina A (SC) sobre a histomorfometria da cartilagem articular normal ou de cartilagem de cães com doença articular degenerativa (DAD) experimental. Os grupos experimentais constituíram-se de animais com articulação direita normal, que não foi submetida a procedimento cirúrgico, e com articulação esquerda osteoartrótica e que foi submetida à intervenção cirúrgica. Os grupos foram subdivididos em animais com articulação não tratada e tratada, portanto: normais (N) (n=5), NGAG (n=5) e NSC (n=4); e osteoartróticos (O) (n=5), OGAG (n=5) e OSC (n=4). Secções de cartilagens do fêmur, da tíbia e da patela foram utilizadas neste estudo. Nos normais (N, NGAG e NSC), não se encontraram lesões que caracterizassem a DAD, embora tenha havido diminuição na celularidade nos de NGAG e NSC, em relação a N. Foram observadas alterações em graus variáveis entre os grupos osteoartróticos. Houve redução acentuada dos condrócitos no grupo O em comparação aos normais enquanto os grupos osteoartróticos tratados apresentaram celularidade semelhante aos normais tratados. Estes resultados foram confirmados pela análise do índice de proporção (IP), que se mostrou elevado em O, indicando menor síntese de proteoglicanos. Não houve diferença significativa entre os IPs dos grupos osteoartróticos tratados (OGAG, OSC) apesar do comportamento distinto do OSC ao assemelhar-se aos grupos N e NSC. Estes resultados sugeriram que o SC agiu na cartilagem osteoartrótica de maneira mais eficaz, reduzindo a perda de proteoglicanos e estimulando a viabilidade celular e a atividade metabólica.

The effects of precursors of glycosaminoglycans (GAG) and chondroitin sulphate A (CS) on the histomorphometry of normal articular cartilage and with experimental degenerative joint disease (DJD) in dogs were evaluated. The groups were constituted as follows: normal joints were not undergone to the surgical procedure and left osteoarthritics that suffered surgical intervention. These were then distributed into joints that did not receive drug treatment and those that received: normal (N) (n = 5); NGAG (n = 5), and NCS (n = 4); and osteoarthritics: O (n = 5); OGAG (n = 5); and OCS (n = 4). Cartilage sections of the femur, tibia, and patella were used in this study. In normal groups (N, NGAG, and NCS) no lesions were found that could characterize DJD, although the cellularity was shown to be slightly diminished in NGAG and NCS, in relation to N. Characteristic DJD disorders were identified in variable degrees among osteoarthritic groups and were more severe in O. There was marked reduction of the number of chondrocytes in group O, as compared to the normal groups, while treated osteoathritic groups showed similar cellularity to that of normal groups. These results were supported by the analysis of the index of proportion (IP), which was high in O, indicating less synthesis of proteoglycans. These results suggest that chondroitin A sulphate acted on osteoarthritic cartilage in a more efficient way than glycosaminoglycan precursors, reducing the loss of proteoglycans caused by the degenerative process, stimulating cellular viability and metabolic activity.

Efeito de glicosaminoglicanos na prevençäo de trombose em enxertos veno-venosos microcirúrgicos no rato / Glycosaminoglicans in the prevention of thrombosis in veno-venous microsurgical grafts in the rat

Visando a contribuir para o desenvolvimento de métodos de prevençäo de trombose em enxertos veno-venosos realizados por técnica microcirúrgica, o presente trabalho teve por objetivo avaliar comparativamente o efeito da heparina, de uma heparina de baixo peso molecular (enoxaparina) e do sulfato de heparan na prevençäo do desenvolvimento de trombo nesses enxertos no rato, utilizando doses antitrombóticas determinadas em modelo de trombose de veia cava. Pretendeu-se também realizar estudo ultra-estrutural dos enxertos em que se pode, eventualmente, prevenir a formaçäo de trombos, visando verificar uma eventual diferença na açäo das drogas sobre a formaçäo dos mesmos e sobre o endotélio. No modelo de ligadura de veia cava, a heparina teve eficácia nas doses de 200 UI/kg EV e 400 UI/kg SC, a enoxaparina nas doses de 1,5 mg/kg EV e 2 mg/kg SC e o sulfato de heparan nas doses de 2,5 mg/kg EV e 15 mg/kg SC. Os animais foram divididos em 4 grupos de tratamento: grupo controle; grupo heparina, grupo enoxaparina e grupo sulfato de heparan. A heparina foi administrada por via intravenosa, em dose de 200 UI por kg, imediatamente antes do início do procedimento cirúrgico e, após 3 horas, complementada com doses de 400 UI por kg, por via subcutânea, de 12 em 12 horas. A enoxaparina foi administrada por via intravenosa, em dose de 1,5 mg por kg, imediatamente antes do início do procedimento cirúrgico e, após 3 horas, complementada com doses de 2,0 mg por kg, por via subcutânea, de 12 em 12 horas. O sulfato de heparan foi administrado por via intravenosa, em dose de 2,5 mg por kg, imediatamente antes do início do procedimento cirúrgico e, após 3 horas, complementada com doses de 15,0 mg por kg, por via subcutânea, de 12 em 12 horas. O enxerto veno-venoso foi realizado em 56 animais. A avaliaçäo desses enxertos foi realizada 15 minutos (16 ratos) e 48 horas (40 ratos) após a liberaçäo do fluxo sangüíneo. No grupo controle, verificou-se trombose oclusiva do enxerto venoso em 9 dos 10 animais. No grupo tratado com heparina, houve trombose oclusiva em 4 dos 10 animais. No grupo enoxaparina, a trombose oclusiva ocorreu em 9 dos 10, e no grupo sulfato de heparan, em 3 dos animais. Houve diferença significante quanto ao número de trombose oclusiva nos enxertos quando se comparam os animais dos grupos heparina e sulfato de heparan com os animais do grupo controle...

Avaliaçäo ultra-estrutural da substância intercelular de polpa de dentes decíduos humanos através do relacionamento entre glicosaminoglicanas e fibrilas colágenas / Ultra-structural evaluation of the ground substance from human deciduos teeth pulp by relationship of glycosaminoglycans and colagen fibrils

O objetivo deste trabalho foi verificar através de microscopia eletrônica de transmissäo, a estrutura da substância intercelular expressa pelo relacionamento das Glicosaminoglicanas (GAGs) com fibrilas colágenas em polpa de dentes decíduos humanos íntegros, hígidos com rizólise e cariados com rizólise. Para isso, as polpas de caninos decíduos removidas após clivagem dos mesmos, foram fixadas em soluçöes de glutaraldeido, tetróxido de ósmio e acetato de uranila. Pudemos verificar, a nível ultra-estrutural, que em polpa de dentes hígidos as Glicosaminoglicanas se apresentaram como uma rede de finíssima trama por todo o campo examinado e conservavam uma relaçäo de integridade com os demais componentes tissulares. Em polpa de dentes decíduos com rizólise, a relaçäo de integridade apresentou-se bastante irregular retratando um quadro de desgaste tissular. Nos casos de dentes decíduos cariados com rizólise, a relaçäo de integridade, encontrada nas polpas de dentes hígidos, aqui se constatou com alteraçöes profundas sugerindo degeneraçäo tissular, quadro este, a nosso ver, agravado pela cárie e com remota possibilidade de recuperaçäo

Um estudo aberto multicêntrico sobre o efeito de um preparado antiinflamatório para aplicaçäo tópica contendo o mucopolissacárido polissulfato (Hirudoid Pomada Luitpold) na prevençäo, reduçäo e alívio dos sintomas da queimadura solar / An open multi-doctor study of the effect of a topically applied anti-inflammatory preparation containing mucopolysaccharide polysulphate (Hirudoid ointment/Luitpold) in preventing, reducing and alleviating the symptoms of sunburn

Um estudo aberto multicêntrico de HIRUDOID Pomada na prevençäo, reduçäo e alívio dos sintomas de queimadura solar foi feito num total de 717 pacientes, dos quais 88 crianças. Este parece ser o primeiro estudo clínico feito e publicado no mundo em queimadura solar em humanos. HIRUDOID foi eficaz na prevençäo e reduçäo dos sintomas (inflamaçäo, dor, eritema e ressecamento da pele) de queimadura solar quando aplicado após exposiçäo ao sol porém antes do aparecimento dos sintomas. HIRUDOID foi também eficaz no alívio dos sintomas após seu aparecimento. Nas duas situaçöes, os resultados foram estatisticamente altamente significantes. Houve baixa incidência de efeitos adversos em crianças e adultos, nenhum deles graves ou duradouros, e em apenas 2,2% da populaçäo houve possível ou provável ligaçäo com HIRUDOID. Näo houve efeitos adversos sistêmicos. A avaliaçäo global dos efeitos preventivos e terapêuticos do HIRUDOID em queimadura solar foi altamente favorável tanto em adultos quanto em crianças com mais de 80% dos médicos classificando o produto com bom ou excelente. Isto foi confirmado pelo fato de que 60% dos pacientes continuaram a aplicar HIRUDOID, espontaneamente, durante 4 a 5 dias após o término das avaliaçöes

Tratamento da epicondilite lateral do úmero através da ionizaçäo com preparado tópico: estudo comparativo

Foi realizado um estudo envolvendo 40 pacientes portadores de epicondilite lateral do úmero na fase aguda. O nosso objetivo era avaliar a eficácia do uso do ácido salicílico, ácido mucopolissacárido polissulfúrico e extrato supra-renal de forma localizada, através da ionizaçäo, comparando esta modalidade terapêutica com a galvanizaçäo. Concluiu-se que a ionizaçäo com ácido salicílico e ácido mucopolissacárido polissulfúrico produz um resultado relativamente imediato no combate à epicondilite lateral do úmero, pois, após quinze sessöes, 70% dos pacientes já haviam recebido alta e somente 10% deste grupo teve resultado insatisfatório, enquanto no grupo tratado com galvanizaçäo 35% dos pacientes näo conseguiram bons resultados após vinte sessöes

Avaliaçäo clínica do ácido mucopolissacárido-polissulfúrico injetável na osteoartrose do joelho / Clinical evaluation of mucopolysaccharide-polysulfate acid injection in osteoarthrosis of the knee

Foi realizado um estudo aberto, näo comparativo para avaliar a eficácia e tolerabilidade do ácido mucopolissacárido-polissulfúrico injetável (AMP) em 147 pacientes portadores de artrose do joelho, estadiamento I (35 casos), estadiamento II (82 casos), estadiamento III (29 casos) e estadiamento IV (1 caso). O ácido mucopolissacárido-polissulfúrico injetável foi administrado por via intramuscular duas vezes semanais durante 8 semanas. Este esquema foi repetido 3 vezes com intervalos de 3 meses. Os resultados evidenciaram que o medicamento promoveu melhora estatisticamente significativa (p <0,01) da: 1-mobilidade (limitaçäo e grau de mobilidade) 2-dor (ao início da movimentaçäo, à movimentaçäo passiva, ao repouso e dor noturna) 3-flexäo e extensäo (limitaçäo) 4-dificuldade em subir e descer escadas. A tolerabilidade foi considerada excelente, registrando-se apenas um caso de efeitos colaterais. A avaliaçäo global do efeito terapêutico mostrou excelentes e bons resultados em 70,06% dos pacientes. Apesar das limitaçöes de um estudo aberto, os resultados demonstraram que o ácido mucopolissacárido-polissulfúrico injetável é um agente terapêutico eficaz no tratamento da artrose do joelho

Avaliaçäo pelo I131 do aumento da perfusäo de retalhos miocutâneos experimentais submetidos ao ácido mucopolissacarídeo polissulfúrico / Improvement of the supply to experimental myocutaneous flaps by mucopolysacharide polysulphuric acid as determined by measuring the uptake of 131I in the flap

Os autores analisam experimentalmente os efeitos do ácido mucopolissacarídeo-polissulfúrico, Hirudoid**R, quanto aos seus efeitos na perfusäo de retalhos miocutâneos de 2 cm x 9 cm no dorso de ratos. Foram utilizados 120 ratos wistar distribuídos em 2 grupos sendo os retalhos do grupo I receptores de uma pomada que constitui o veículo de substância em estudo e no grupo II a mesma pomada acrescida de ácido mucopolissacarídeo-polissulfúrico na concentraçäo 0,3 g%. Os grupos foram avaliados no 1§ e 3§ dias pós-operatório pela captaçäo do I**131. Como resultado, os retalhos que receberam o ácido mucopolissacarídeo-polissulfúrico, apresentaram aumento de perfusäo, quando comparados ao controle. Este aumento de perfusäo retrata significativo valor por ser uma melhora da oxigenaçäo dos tecidos na fase aguda de sofrimento celular do pós-operatório próximo